Pentru a preveni contaminarea încrucișată în timpul funcționării, principalele cerințe pentru proiectarea, construcția și gestionarea funcționării sale sunt:
(1) Proiectarea și construcția laboratoarelor, sistemul de lucru sigur sau procedurile de operare standard de siguranță trebuie să îndeplinească cerințele actualelor "Cerințe generale pentru biosigurasigurarea laboratorului" GB19489.
2. PCR este împărțit în patru zone funcționale în funcție de etapele de lucru, și anume zona de depozitare și preparare a reactivilor, zona de preparare a specimenelor, zona de amplificare și zona de analiză a produsului de amplificare. Dacă este echipat un instrument PCR fluorescent în timp real, zonele de amplificare și analiză a produsului pot fi combinate. Fiecare zonă funcțională trebuie să fie marcată clar, iar echipamentele și articolele din diferite zone funcționale nu trebuie amestecate.
Direcția fluxului de aer a laboratorului PCR poate fi realizată în conformitate cu zona de stocare și pregătire a reactivului→zona de preparare a specimenelor→zona de amplificare→zona de analiză amplificată a produsului pentru a preveni pătrunderea produselor amplificate în zona preamplificată împreună cu fluxul de aer. Aceasta poate fi efectuată în modul de scădere a presiunii aerului din zona de depozitare și preparare a reactivilor → zona de preparare a specimenelor → zona de amplificare → zona de analiză a produsului de amplificare. Aceasta poate fi realizată prin instalarea ventilatoarelor de evacuare, a dispozitivelor de evacuare a presiunii negative sau a altor metode fezabile.
3. Intrarea în fiecare zonă de lucru trebuie să urmeze cu strictețe o singură direcție, adică zona de depozitare și preparare a reactivilor → zona de preparare a specimenelor → zona de amplificare → zona de analiză a produsului de amplificare. Trebuie utilizate diferite zone de lucru (cum ar fi culori diferite). Lucrătorii nu trebuie să scoată haine de lucru atunci când părăsesc fiecare zonă de lucru.
(4) Curățarea laboratorului trebuie efectuată în direcția depozitării reactivilor și a zonei de preparare→zona de preparare a specimenelor→zona de amplificare→zona de analiză amplificată a produsului. Diferite zone experimentale ar trebui să aibă propriile aparate de curățare pentru a preveni contaminarea încrucișată.
5. După terminarea lucrărilor, zona de lucru trebuie curățată imediat. Suprafața bancului de laborator din zona de lucru trebuie să poată rezista la efectele de dezinfectare și curățare ale substanțelor chimice, ar fi hipocloritul de sodiu. Iradierea ultravioletă de pe suprafața bancului de laborator ar trebui să fie convenabilă și eficientă. Deoarece distanța și energia iradierii ultraviolete sunt foarte critice pentru efectul de decontaminare, se poate utiliza o lampă ultravioletă mobilă (lungime de undă de 254nm), iar după finalizarea lucrării, aceasta poate fi reglată pentru a iradia în limita a 60-90cm pe masa experimentală. Deoarece produsul amplificat este doar câteva sute sau zeci de perechi de bază (bp), nu este sensibil la deteriorarea UV, astfel încât fragmentul amplificat cu UV trebuie să fie iradiat pentru o perioadă mai lungă de timp, de preferință peste noapte.
Funcțiile zonei de depozitare și preparare a reactivilor sunt: prepararea reactivilor de stocare, distribuirea reactivilor și prepararea amestecului de reacție de amplificare, precum și depozitarea și prepararea consumabilelor, ar fi tuburile și vârfurile de centrifugare. Materialele, ar fi reactivii de depozitare și consumabilele utilizate pentru prepararea specimenelor, ar trebui transportate direct în zona de depozitare și preparare a reactivilor și nu pot trece prin zona de detectare a amplificării. Materialele de control pozitiv și materialele de control al calității din kit nu trebuie depozitate în această zonă, ci trebuie depozitate în această zonă. Zona de prelucrare a specimenelor.
Funcția zonei de preparare a specimenului este: extracția acidului nucleic (ARN, ADN), depozitarea și adăugarea la tubul de reacție de amplificare. Pentru operațiunile care implică probe clinice, ar trebui îndeplinite cerințele privind echipamentele de protecție, protecția personală și specificațiile de funcționare pentru laboratoarele secundare de biosigura siguranță. Deoarece contaminarea cu aerosoli poate apărea în timpul amestecării probelor și al purificării acidului nucleic, pot fi stabilite condiții de presiune pozitivă în această zonă pentru a evita contaminarea cu aerosoli din zonele învecinate. Pentru a evita contaminarea încrucișată între eșantioane, după adăugarea acidului nucleic care urmează să fie testat, trebuie acoperit tubul de reacție care conține amestecul de reacție. Pentru materialele potențial infecțioase, capacul trebuie deschis în dulapul de siguranță biologică și trebuie să existe proceduri clare pentru manipularea și inactivarea probelor.
Funcția zonei de amplificare este: sinteza ADN-ului, amplificarea și detectarea ADN-ului. Pentru a evita poluarea cauzată de aerosoli, mersul pe jos în zonă ar trebui să fie redus la minimum. Trebuie remarcat faptul că toate tuburile de reacție testate nu trebuie deschise în această zonă.
Funcția zonei de analiză a produsului amplificat este: analiza și determinarea în continuare a fragmentelor amplificate, ar fi hibridizarea, electroforeza digestiei enzimelor, denaturarea analizei lichidelor de înaltă performanță, secvențierea etc. Produsele de amplificare a acidului nucleic au diferite metode de analiză, ar fi metode de hibridizare a sondelor pe membrane sau pe microplăci sau cipuri (etichetarea radionuclizilor sau etichetarea nuclizilor neradioactivi), electroforeza directă sau digerată a gelului de agaroză, electroforeza gelului poliacrilamidă, transferul sudic, metodele de secvențiere a acidului nucleic, spectrometria de masă etc.
Zona de analiză a produsului de amplificare este principala sursă de contaminare a produsului de amplificare în laboratorul PCR, de aceea trebuie să se aibă grijă să se evite transportul produsului de amplificare prin articolele și hainele de lucru din acest domeniu. Atunci când se utilizează metoda PCR-ELISA pentru detectarea produselor amplificate, trebuie utilizată o mașină de spălat plăci, iar lichidul rezidual trebuie colectat în 1 mol/L HCl și nu poate fi turnat în laborator, dar trebuie aruncat departe de laboratorul PCR. Drop. Vârful utilizat trebuie, de asemenea, să fie înmuiat în 1 mol/L HCl și apoi plasat într-un sac de gunoi pentru eliminare conform procedurilor, ar fi incinerarea. Deoarece această zonă poate utiliza anumite mutații genetice și substanțe toxice, ar fi bromura de etidiu, acrilamidă, formaldehidă sau radionuclizi etc., trebuie acordată atenție protecției siguranței experimentatorilor.